ارزیابی اثرات مهاری و همافزایی عصاره الکلی گیاه سنبله نقرهای byzantina( )Stachys روی سویه های استاندارد در شرایط آزمایشگاهی

Transcript

1 مقاله تحقیقی مجلة دانشگاه علوم پزشكی بابل دوره نوزدهم شماره 5 اردیبهشت 6931 صفحه ارزیابی اثرات مهاری و همافزایی عصاره الکلی گیاه سنبله نقرهای byzantina( )Stachys روی سویه های استاندارد در شرایط آزمایشگاهی رویا سفرکار )PhD( 6 5 رضا بنابی )MSc( 2 علیرضا مسیحا )PhD( *9 مریم رضایی نظیفی )MSc( 6 رضا ستوده )BSc( 6 -باشگاه پژوهشگران جوان دانشگاه آزاد اسالمی واحد آستارا 2 -گروه علوم پزشكی دانشكده پزشكی دانشگاه آزاد اسالمی واحد اردبیل 9 -گروه بیوتكنولوژی دانشكده علوم پایه دانشگاه آزاد اسالمی واحد الهیجان 6 -گروه میكروبیولوژی دانشكده علوم پایه دانشگاه آزاد اسالمی واحد اردبیل 5 -گروه شیمی دانشكده علوم پایه دانشگاه آزاداسالمی واحد اردبیل خالصه دریافت: 35/66/63 اصالح: 35/62/6 پذیرش: 31/6/22 سابقه و هدف: گیاهان خانواده نعناع با داشتن خاصیت ضد میكروبی در درمان بیماریهای عفونی مورد استفاده قرار می گیرند. عصاره الكلی گیاه سنبله نقرهای بر روی پنج سویه استاندارد در شرایط آزمایشگاه ی مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه اثرات مهاری همافزایی و کاهندگی مواد و روشها: در این مطالعه تجربی گیاه سنبله نقرهای byzantina( )Stachys پس از جمع آوری به دور از نور مستقیم و درسایه خشك شد. تهیه عصاره الكلی با استفاده از روش خیساندن انجام گرفت تاثیر عصاره به روش دیسك دیفیوژن درغلظت های /5 و 522 میلی گرم بر میلی لیتر عصاره به مقدار 22μl مورد آزمایش قرار گرفت. سویههای میكروبی مورد آزمایش بهصورت لیوفیلیزه خریداری شد. برای تعیین MIC و MBC از روش میكرودایلوشن استفاده بررسی شد. یافته ها: در این بررسی بیشترین میزان اثر اثر شد. همچنین اثر همافزایی عصاره با آنتیبیوتیك عصاره روی استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس درغلظت 522 میلیگرم بر میلی لیتر برابر با 29/2±6/7 میلیمتر مشاهده شد. درحالیكه این روی باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس برابر با 68/6±6/8 میلیمتر استرپتوکوکوس گروه A برابر با 66/6±2/6 میلیمتر و سودوموناس آئروجینوزا معادل 66/7±2/6 میلیمتر تعیین شد. همچنین با افزایش غلظت عصاره قطر هاله بازدارندگی به طور معنیداری )2/25 p( افزایش یافت. فعالیت همافزایی عصاره با جنتامیسین اریترومایسین و پنیسیلین با سودوموناس آئروجینوزا نشان داده شد. نتایج فیتوشیمیایی حضور آلكالوئید کربوهیدرات تانن ترپنوئید استروئید ساپونین و فالونوئید را نشان داد. نتیجهگیری: به نظر می رسد عصاره گیاه سنبله نقرهای میتواند به تنهایی یا در ترکیب با سایر عوامل ضد میكربی اثر مهارکنندگی داشته و عملكرد برخی از آنتیبیوتیكها را تقویت نماید. کلمات کلیدی: عصاره الكلی سنبله نقرهای ترکیب فیتوشیمیایی فعایت ضد میكروبی اثرهمافزایی. استخیس بیزانتینا byzantina( )Stachys )مترادف با استخیس الناتا.S )Lanata یكی از گونه های دارویی این جنس است که دارای ساختار علفی مقدمه شیوع امروزه با افزایش استفاده از آنتی بیوتیك ها زای بیماری های سویه افزون روز و داروهای ضد میكروبی شاهد بیوتیك آنتی چندین به مقاوم هستیم) 6 (. به علت افزایش مقاومت آنتی بیوتیكی تحقیقات در جهت دستیابی به موادی که اثرات مفید بیشتر و اثرات جانبی کمتری را نشان دهند گسترش یافته است )2( در حال حاضر بخش عمده داروهای مدرن شیمیایی هستند ولی در عین حال تقریببا 622 درصد فراورده های دارویی منشاء گیاهی دارد )9(. استفاده از گیاهان دارویی بومی که عالوه بر سازگاری های اکولوژیكی قادرند با سنتز مواد موثره ثانوی و فعال در پیشگیری و درمان بیماری ها موثر واقع شوند در سال های اخیر جایگاه ویژه ای در علم پزشكی یافته است) 6 (. توجه به گیاهان دارویی با خواص ضد میكروبی می تواند مشكالت رایج در استفاده از آنتی بیوتیك ها را خصوصا به علت عوارض جانبی مرتفع سازد) 5 (. گیاه سنبله نقرهای با نام علمی پایا همراه با کرك های فراوان کرکینه پوش- پشمین و تارهای بلند می باشد. این گیاه بومی ترکیه ارمنستان و ایران است که پراکنش آن در مناطق مختلف ایران خصوصا در نواحی شمالی البرز و شمال غرب کشور می باشد. )1-8(. خانواده نعناعیان یكی از بزرگترین خانواده های گیاهی است که دارای پراکنش جهانی می تیره باشد. این خانواده با حدود 222 سرده و 2 تا 5 هزار گونه از بوته های معطر دارای خواص دارویی گسترده است. سرده )Stachys( سنبله ای از این حدود 922 گونه را به خود اختصاص داده است. Stachys از واژه Chistets به معنی تمیز کننده و بهبود دهنده زخم گرفته شده است که نشانگر استفاده وسیع اسانس و یا عصاره گونه های این سرده به عنوان آنتی سپتیك amirmassiha@yahoo.com این مقاله حاصل طرح تحقیقاتی به شماره * مسئول مقاله: دکتر علیرضا مسیحا دانشگاه آزاد اسالمی واحد آستارا می باشد. آدرس: الهیجان دانشگاه آزاد اسالمی دانشكده علوم پایه گروه بیوتكنولوژی. تلفن:

2 مجله دانشگاه علوم پزشكی بابل دوره نوزدهم/ شماره 5/ اردیبهشت 6931 ارزیابی اثرات مهاری و همافزایی عصاره الكلی گیاه سنبله رویا سفرکار و همكاران 62 )ضدعفونی کننده( و درمان کننده بیماری های پوستی می باشد )3(. گیاهان تیره ATCC و اشرشیاکلی ATCC بودند که از مرکز کلكسیون نعناع با داشتن خاصیت ضد میكروبی در درمان بیماریهای عفونی به خصوص اسهال تب سرماخوردگی و بهداشت دهان و دندان مورداستفاده قرار میگیرند ) 66 و 62 (. در منابع طب سنتی ایران و جهان نیز اثرات درمانی متعددی از جمله اثرات خواب آور آرام بخش پایین آورنده فشارخون التیام زخم توقف خون ریزی افزایش دهنده ترشحات صفراوی ضدسرفه و گلودرد عفونتهای کلیه و مسكن را به گونه های مختلف جنس Stachys نسبت می دهند ) 69 و 62 ( همچنین در تحقیقات مختلف دیگر نیز به اثرات آنتی اکسیدانی ضد باکتریایی ضدالتهابی و ضدسرطانی آنها اشاره شده که اغلب به کمیت و کیفیت مواد موثره ترپنوییدی فنولی و فالونوییدهای موجود در اسانس و عصاره گونه های جنس Stachys اشاره شده است )66-68(. مواد از آنجاییكه تنوع پوشش گیاهی و کیفیت مواد موثره دارویی در گیاهان هر منطقه متاثر از تنش های اکولوژیكی و حتی فنولوژی گونههای آن منطقه می باشد) 22 و 63 (. لذا رویكرد جامعه جهانی بهداشت به سمت شناسایی نیازهای اکولوژیكی گونه ها دررویشگاه های طبیعی اتنوفارماکولوژی استخراج مواد موثره و از همه مهمتر بررسی خواص آنتی اکسیدانی آنها با هدف احیا کشت استخراج طبیعی موثره ازآنجاییكه استان می خطر کم و طبیعی داروهای تولید و باشد) 22 و 26 (. گیالن به دلیل برخورداری از شرایط اکولوژیكی رویشگاه های متنوعی ازگیاه سنبله نقرهای را در خود جای داده که طب سنتی منطقه برخوردار است از اهمیت بالقوه ای نیز در بنابراین پژوهش حاضر با هدف بررسی اثر مهارکنندگی و همافزایی عصاره الكلی گیاه سنبله نقرهای byzantina( )Stachys جمع آوری شده از منطقه گردنه حیران بر روی سویه های استاندارد در شرایط آزمایشگاهی انجام گرفت. مواد و روش ها جمع آوری گیاه و استخراج عصاره: در این مطالعه تجربی برگهای گیاه سنبله نقرهای در اردیبهشت ماه از منطقه گردنه حیران جمع آوری و در مكانی به دور از آفتاب خشك گردید. سپس برگ های خشك شده با استفاده از آسیاب مدل Waring بهصورت پودر آماده تهیه شد. سپس بهمنظور تهیه عصاره الكلی 62 گرم پودر آسیاب شده در 52 میلی لیتر اتانل 31 درجه )محصول شرکت مرك آلمان( ریخته شد و به مدت ساعت در دمای آزمایشگاه نگهداری شد و هر چند ساعت یك بار هم زده شد. سپس مایع رویی جدا و به روش ماسراسیون )Maceration) در خالء تغلیظ شد) 29 (. جهت استاندارد کردن روش و تكرارپذیری و بهمنظور مقایسه و ارزیابی اثر ضد میكروبی عصارههای استخراج شده بهوسیله آب مقطر و اتانول وزن خشك عصاره ها تعیین شد. ابتدا وزن یك لولهآزمایش توسط ترازوی حساس دیجیتالی) 2/2226 (تعیین شد و پس از آن 6 میلیلیتر از عصاره الكلی در آن ریخته شد سپس محتوی لوله دردمای اتاق خشك شد. سرانجام لولهها مجددا توزین و باکم کردن وزن لولههای خالی میانگین وزن خشك عصارههای آبی و اتانولی تعیین شد) 26 (. تهیه سویههای میكروبی: سویههای میكروبی مورد آزمایش در این پژوهش شامل استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 5329 استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس ATCC استرپتوکوکوس گروه AATCC سودوموناس آئروجینوزا قارچها و باکتریهای صنعتی و عفونی سازمان علمی پژوهشی و صنعتی ایران تهیه گردیدند. سوسپانسیون میكروبی با استفاده از استاندارد نیم مك فارلند تهیه گردید ) 21 و 25 (. بررسی اثر ضد میكروبی عصاره: جهت بررسی اثر ضد میكروبی از روش انتشار در آگار و دیسك دیفیوژن استفاده شد. باکتری ها بر روی محیط مولر هینتون آگار به مدت 26 ساعت کشت داده شدند. سوسپانسیونی با رقت 2/5 مك فارلند در محیط مولر هینتون براث )محصول شرکت مرك آلمان( تهیه شد. سپس یك میلی لیتر از سوسپانسیون میكروبی به صورت چمنی در سطح پلیت حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت و سپس دیسك های بالنك بر روی سطح پلیت آلوده به باکتری قرار داده شد. مقدار 22 میكرولیتر از عصاره های رقیق شده با غلظت های مختلف روی دیسك هاریخته شد. قطر هاله ممانعت از رشد بعد از 26 ساعت انكوباسیون دردمای 97 درجه سانتیگراد اندازه گیری شد. رقیق سازی عصاره ها با استفاده از دی متیل سولفوکساید )DMSO( 62 درصد انجام شد. در این مطالعه از غلظتهای 12/ و 522 میلیگرم در میلی لیترازعصاره استفاده شد. از آنتی بیوتیك کلرامفنیكل به عنوان کنترل مثبت استفاده شد )27(. درروش انتشار در آگار دو چاهك در محیط مولر هینتون آگار به قطر 7 میلی لیتر ایجاد شد. از سوسپانسیون باکتریایی معادل نیم مك فارلند بر روی محیط کشت داده شد. در یكی از چاهك ها آنتی بیوتیك شاهد و در چاهك دیگر عصاره گیاهی با غلظت های 12/ و 522 میلیگرم در میلی لیتر ریخته شد. سپس پلیت ها به مدت 26 ساعت در انكوباسیون در دمای 97 درجه سانتی گراد قرار داده شد. نتایج بر اساس اندازه گیری قطر هاله های عدم رشد توسط آنتی بیوتیك و عصاره گیاهی ثبت شد ) 28 و 26 و 22 (. رشد آزمایشات باکتری )MIC( حداقل 9 بار تكرار شدند. برای تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی غلظت وحداقل کشندگی باکتری )MBC( از روش میكرودایلوشن method( )Micro dilution استفاده گردید. بدین صورت که سوسپانسیونی با غلظت معادل لوله 2/5 مك فارلند از باکتری در محیط (TSB) Trypticase Soy Broth تهیه شد. سریال های رقت معادل /5 1/25 میلی گرم در میلی لیتراز عصاره تهیه و 72 میكرو لیتر از آن ها به میكرو پلیت های 31 خانه ایی که قبال حاوی 72 میكرولیتر سوسپانسیون باکتری با کدورت نیم مك فارلند بودند اضافه گردید. سپس آزمایشات مشابه برای کنترل مثبت )محیط کشت حاوی باکتری و بدون عصاره( و کنترل منفی )محیط کشت بدون باکتری( نیز انجام شد. میكروپلیت ها سپس به مدت 26 ساعت در انكوباتور 97 درجه گرم خانه گذاری گردیدند. کمترین رقت از عصاره که کدورتی در آن مشاهده نشد به عنوان حداقل غلظت مهارکنندگی گزارش شد. از تمام خانه هایی که رشد باکتری در آن ها کامال متوقف شده بود به پلیت های حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد و 26 ساعت در دمای 97 درجه گرم خانه گذاری شدند. هایی غلظت گردیدند) 92 و 23 (. عنوان به بودند باکتری رشد که فاقد بررسی اثر ترکیبی عصاره گیاهی و دیسكهای آنتیبیوتیك: MBC گزارش برای تعیین اثر ترکیبی میان عصاره الكی و دیسكهای آنتیبیوتیك از روش انتشار از دیسك

3 66 J Babol Univ Med Sci; 19(5); May 2017 An Evaluation of the Inhibitory and Synergistic Effects ; R. Safarkar, et al P-value 2/265 2/225 2/265 2/252 2/31 استفاده شد. بررسی اثرات همافزایی و کاهندگی عصاره بر آنتیبیوتیك با استفاده از غلظت تحت مهاری (Sub-MIC) انجام شد. رقت مورد استفاده برابر با رقت 6 به 2 تا 6 به MIC 6 است. غلظت تحت مهاری عصاره با رقت 6 به 2 MIC به محیط مولر هینتون آگار اضافه و بهعنوان پلیت تست استفاده شد. سوسپانسیون باکتریایی با غلظت 62 6/5 8 cfu/ml )معادل نیم مك فارلند( روی محیط کشت آگار حاوی غلظتهای تحت مهاری اسانس توسط سواب بهصورت چمنی کشت داده شد و دیسكهای آنتیبیوتیك روی سطح آگار قرار داده شدند. سپس دیسكها پس قطر هالههای مهاری ( IZD )Inhibition Zone Diameter- از 26 ساعت در دمای 97 درجه سانتیگراد ثبت شد. برای بررسی اثر متقابل اسانس بر آنتیبیوتیك از دیسكهای آنتیبیوتیك پنیسیلین )92 میكروگرم( جنتامایسین )62 میكروگرم( و اریترومایسین )65 میكروگرم( محصول شرکت پادتن طب استفاده شد. تشخیص ماهیت ترکیبات آلی: برای تشخیص مواد آلی موجود در نمونه پودر خشك شده از روش خیساندن در آب استفاده شد و مواد آلی موجود در نمونه گیاهی با روشهای استاندارد موجود مورد بررسی قرار گرفت) (. آنالیز آماری: مقایسه میانگین قطر هاله ها و بررسی قدرت ضد میكروبی عصاره در مقایسه با یكدیگر با استفاده از نرم افزار SPSS 66 و آزمون های آماری واریانس یك طرفه )ANOVA( و آزمون های تكمیلی HSD( )Tukey تجزیه یافته ها و تحلیل گردید و 2/25>p معنی دار در نظر گرفته شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که اثر ضد میكروبی عصاره الكلی گیاه سنبله نقرهای وابسته به غلظت بوده و همراه با افزایش غلظت عصاره قطر هاله بازدارندگی به طور معنیداری )2/25 p( افزایش می یابد. این مطالعه نشان داد که نوع باکتری وغلظت عصاره بر روی قطر هاله عدم رشد موثر است بطوریكه قطر هاله بازدارندگی در غلظت 522 میلی گرم بر میلی لیتر عصاره الكلی برای استافیلوکوك اپیدرمایدیس معادل 29/2±6/7 استافیلوکوکوس اورئوس 68/6±6/8 استرپتوکوکوس گروه 66/6±2/6 A و سودوموناس آئروجینوزا به میزان 66/7±2/6 میلیمتر مشاهده شد. کمترین میزان حساسیت در ارتباط با باکتری اشرشیاکلی معادل 5±2/6 بدست آمد )جدول 6(. همچنین با افزایش غلظت عصاره فعالیت ضد باکتریایی آن علیه باکتری های مورد آزمون افزایش یافت. غلظتهای مختلف در باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس و استرپتوکوکوس گروهA در مقایسه با شاهد منفی تفاوت معنی داری داشت )2/25>p(. قطر هاله عدم رشد در خصوص سودوموناس آئروجینوزا از نظر آماری متفاوت از یكدیگر نبودند و خاصیت ضد باکتریال غلظت های مختلف عصاره برروی این باکتری تقریبا مشابه بود. نتایج مشابهی در خصوص اشرشیاکلی بدست آمد )جدول 2(. نتایج نشان می دهد که عصاره الكلی این گیاه بیشترین اثر مهارکنندگی و کشندگی را بر روی استافیلوکوکوس اورئوس داشته است. عصاره گیاه سنبله نقرهای باعث افزایش اثر آنتیبیوتیك جنتامایسین اریترومایسین و پنیسیلین برعلیه باکتری سودوموناس آئروژینوزا شد. عالوه بر این عصاره همراه با آنتیبیوتیكهای جنتامایسین اریترومایسین و پنیسیلین خاصیت آنتاگونیستی بر رشد باکتریهای منتخب نشان داد. تعامل عصاره به همراه آنتیبیوتیك جنتامایسین هیچ تأثیری بر رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس نشان نداد. همچنین آنتیبیوتیك پنیسیلین به همراه عصاره بر ضد استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس واجد اثر آنتاگونیستی بود. پنیسیلین و اریترومایسین بر ضد اثر سینرجیسمی عصاره بر سویههای استرپتوکوکوس گروه عملكرد و A سودوموناس آئروژینوزا نشان داده شد. درحالیکه این اثر بر روی اشرشیاکلی بر عملكرد آنتیبیوتیكها بیتأثیر بوده است )جدول 9(. همچنین نتایج آزمایشات فیتوشیمیائی در جدول شماره 6 آمده است. جدول 6. میانگین قطر هاله عدم رشد باکتریهای منتخب در حضور عصاره الكلی غلظت عصاره استافیلوکوکوس اورئوس استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس استرپتوکوکوس گروهA سودوموناس آئروجینوزا اشرشیاکلی سنبله نقرهای برحسب میلیمتر به روش انتشار دراگار mg/ml12/5 Mean±SD 66±2/3 a 68±2/6 a 7/5±6/3 a 8/2±2/6 a 2±2/5 a mg/ml625 Mean±SD 62/2±6/7 b 22/2±6/7 bc 62/2±2/7 b 3±6/8 ab 2/8±2/5 ab mg/ml252 Mean±SD 66/5±2/9 c 26/5±6/7 c 62/5±2/3 c 62/5±2/3 bc 9/2±2/3 b mg/ml522 Mean±SD 68/6±6/8 d 29/2±6/7 d 66/6±2/6 d 66/7±2/6 d 5±2/6 c حروف التین غیر مشابه نشان دهنده وجود اختالف معنى دارى )2/25 p( می باشد جدول 2. نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی )MIC( وکشندگی رشد )MBC( در غلظت های مختلف عصاره الكلی سنبله نقرهای به روش میكرودایلوشن براث بر حسب mg/mlg (mg/ml) MBC میكروارگانیسم 25 استافیلوکوکوس اورئوس 622 استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس 622 استرپتوکوکوس گروهA 622 سودوموناس آئروجینوزا 622 اشرشیاکلی MIC(mg/ml) 62/ جدول 9. ارزیابی اثرات همافزایی و کاهندگی عصاره الكلی سنبله نقرهای با آنتیبیوتیكهای اریترومایسین پنیسیلین و جنتامایسین روی باکتریهای منتخب برحسب میلیمتر جنتامایسین پنیسیلین آنتیبیوتیك A(AE) A(AE) میكروارگانیسم 65/69 65/65 استافیلوکوکوس اورئوس 63/22 63/62 استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس 62/61 62/22 استرپتوکوکوس گروه A 66/95 66/26 سودوموناس آئروجینوزا 2 2 اشرشیاکلی اریترومایسین A(AE) 65/26 63/25 62/22 66/22 2 A: قطر هاله عدم رشد برای آنتیبیوتیك موردنظر :AE قطر هاله عدم رشد برای آنتیبیوتیك به همراه عصاره

4 مجله دانشگاه علوم پزشكی بابل دوره نوزدهم/ شماره 5/ اردیبهشت 6931 ارزیابی اثرات مهاری و همافزایی عصاره الكلی گیاه سنبله رویا سفرکار و همكاران 62 بحث و نتیجه گیری جدول 6. ترکیب فیتوشیمیایی عصارهالكلی سنبله نقره ای ترکیب آلی Alkaloids Amino acids Carbohydrates Flavonoids Glycosides Tannins Phenol Terpenoids Steroids Saponin Volatile oils () Present, (-) absent بر اساس نتایج این تحقیق مشخص شد که عصاره الكلی این گیاه در غلظت 522 میلیگرم بر میلیلیتر اثرات ضدباکتریایی قابل توجهی روی استافیلوکوك اپیدرمایدیس دارد اما این عصاره در غلظت های کم اثرضدمیكروبی ندارد. وجود یا عدم وجود تفاوت معنیدار میانگین قطر عدم رشد غلظتهای مختلف را میتوان به مقدار ماده مؤثر موجود در عصارهها نسبت داد و میتوان نتیجه گرفت که با افزایش غلظت میزان قطر هاله عدم رشد نیز افزایش پیدا میکند. نتایج این پژوهش با گزارش از Skaltsa و همكاران میكروارگانیسمها همخوانی دارد اما از لحاظ اثر مهاری عصاره بر رشد از لحاظ اینكه عصاره اتانولی بر رشد باکتری سودوموناس ائروجینوزا و اشرشیاکلی کامال بیاثر بوده است مغایرت دارد) 69 (. این امر ممكن است به علت استخراج بیشتر مواد موثردر گیاه بهوسیله اتانول باشد. بهطورکلی باکتریهای گرم مثبت نسبت به عصارههای گیاهی باکتریهای گرم منفی میباشند )95(. این پدیده ممكن است حساس تر به علت تحمل ذاتی باکتریهای گرم منفی و ماهیت و ترکیبات گیاهی باشد. مطالعات مختلف نشان داده است که دیواره سلولی باکتریهای گرم مثبت نسبت به باکتریهای گرم منفی در مقابل بسیاری از آنتیبیوتیكها ترکیبات شیمیائی ضد میكروبی )91( و حتی بسیاری از داروهای گیاهی )97( حساسیت زیادی دارند. با در نظر گرفتن اختالف اثرات ضد میكروبی در میكروارگانیسمهای تست میتوان نتیجه گرفت که تفاوت در مورد سوش های موردبررسی بسیار حائز اهمیت است. مطالعه Dulger و همكاران نشان داد که متانولی عصاره حاصل از گونههای مختلف استخیس بر روی باکتریهای اشریشاکلی استافیلوکوکوس اورئوس کلبسیال پنومونیه سودوموناس آئروژینوزا پروتئوس ولگاریس باسیلوس سرئوس مایكوباکتریوم لیستریا ماتیز و اسمگ مونوسیتوژن مؤثراست )98( همچنین در مطالعه ای که بر روی اثرات ضد باکتری اسانس گیاهان استخیس کریسانتا )S.chrysantha( و استخیس کادینا) S.cadina ( صورت گرفت نشان داده شد که اسانسهای مورد مطالعه اثرات ضد باکتریایی مناسبی بر روی باکتریهای گرم مثبت استافیلوک كو طالیی و استرپتوکوك اپیدرمیس و گرم منفی اشرشیاکلی کلبسیالپنومونیه و سودوموناس آئروژینوزا دارند. مطالعات انجام شده بر روی گونههای مختلف جنس استخیس حاکی از اثرات آنتی باکتریال آنها میباشد) 69 (. MIC نتایج نشان داد عصاره اتانولی این گیاه برای باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس استرپتوکوکوکوس گروه A سودوموناس آئروژینوزا بین 62/5 تا 622 میلیگرم بر میلیلیتر بوده است بنابراین میتوان نتیجه گرفت بیشترین مقاومت مربوط به باکتری گرم منفی اشرشیاکلی می باشد. در این مطالعه اثرات عصاره گیاه بر روی عملكرد چند آنتیبیوتیك معمول که بر روی سویههای استاندارد باکتری اثر داده شده بود موردبررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که عصاره سنبله نقرهای تنها بر روی عملكرد آنتیبیوتیك پنیسیلین بر ضد استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس واجد اثر آنتاگونیستی میباشد و بر روی عملكرد افزایش جنتامایسین بر ضد استافیلوکوکوس اورئوس اثری ندارد ولی موجب حساسیت اریترومایسین می گردد. سودوموناس آئروژینوزا عصاره این گیاه به تنها پنیسیلین جنتامایسین و عملكرد بر پنیسیلین و اریترومایسین بر ضد سویههای استرپتوکوکوس گروه A و سودوموناس آئروژینوزا اثر سینرژیسمی داشت اثری نداشت. دیگر عملكرد و بر آنتیبیوتیكها سویه دو این در ازآنجاییكه مقاومت باکتریایی در حال افزایش است و انتقال مقاومت از باکتریهای باکتریهای به مقاوم مختلف طرق از حساس صورت بهآسانی میگیرد و موجب مقاومت در برابر آنتیبیوتیكهای مصرفی معمول میگردد لذا عصاره استخیس بیزانتینا همچون دیگر مشتقات گیاهان دارویی با خواص آنتی باکتریال میتواند بهعنوان ترکیب جایگزین و یا مكمل در درمان عفونتهای باکتریایی بكار رود )93(. با توجه به مشكالت ناشی از ایجاد مقاومت آنتیبیوتیكی در درمان عفونتها توجه خاصی برای حل این موضوع ضروری به نظر میرسد از سوی دیگر مواد غذایی و مكملهایی که افراد مختلف و بیماران مصرف مینمایند میتوانند بر عملكرد آنتیبیوتیكها اثرات تقویتی یا بازدارنده داشته باشند و مواد تشكیلدهنده گیاهان دارویی میتوانند در بازگشت حساسیت باکتریها به آنتیبیوتیكهایی که در شرایط فعلی به دلیل مقاومت دارویی قابلیتهای درمانی خود را از دست دادهاند مؤثر باشند )62(. نتایج آزمایشهای فیتوشیمیایی نشان داد که عصاره اتانولی این گیاه دارای آلكالوئید کربوهیدرات تانن ترپنوئید استروئید ساپونین و فالونوئید می باشد. مطالعات صورت گرفته در سالهای اخیر مشخص کرده است که فالوونوئیدها بر روی طیف وسیعی از میكروارگانیسمها خاصیت مهارکنندگی دارند این خاصیت میتواند به علت اتصال به پروتئینهای خارج سلولی اتصال به دیواره سلولی باکتریها یا به علت متالشی کردن غشای باکتریها باشد )66(. نتایج این مطالعه نشان داد که عصاره گیاهی سنبله نقره ای دارای اثرات ضد باکتریایی است و این مطالعه امكان استفاده از این گیاه را بهعنوان یك ماده آنتی باکتریال بهویژه در مینماید. مطرح دارویی مقاومت موارد اثرات دارای عصاره این همچنین سینرژیستی با چندین آنتیبیوتیك ازجمله پنیسیلین و اریترومایسین است و میتواند اثر این داروها را افزایش دهد و امكان استفاده آن را بهعنوان مكمل دارویی مطرح مینماید. در ادامه الزم است مطالعات بیشتر و دامنهداری در

5 69 J Babol Univ Med Sci; 19(5); May 2017 An Evaluation of the Inhibitory and Synergistic Effects ; R. Safarkar, et al شرایط محیطی invivo انجام شود تا غلظت مؤثر و ماده مؤثره این عصارهها بر باکتریهای موردنظر و سویههای بالینی و اثرات جانبی آنها در این غلظتهای بهکاررفته مورد ارزیابی قرار گیرد تا درنهایت بتوان پس از مراحل تكمیلی این عصارهها را بهعنوان یك داروی جدید ضد میكروبی به دنیا معرفی نمود. تقدیر و تشكر بدینوسیله از مدیریت و کارکنان مجتمع تحقیقاتی تولیدی و آزمایشگاهی زیست فرآورد پارس جهت فراهم نمودن امكانات و وسایل و تجهیزات برای این تحقیق تشكر و قدردانی می گردد.

6 مجله دانشگاه علوم پزشكی بابل دوره نوزدهم/ شماره 5/ اردیبهشت 6931 ارزیابی اثرات مهاری و همافزایی عصاره الكلی گیاه سنبله رویا سفرکار و همكاران 66 An Evaluation of the Inhibitory and Synergistic Effects of Alcoholic Extract of Stachys Byzantina on Standard Strains under in vitro Conditions R. Safarkar (PhD) 1, R. Bonabi (MSc) 2, A. Massiha (PhD) 3, M. Rezaei Nazifi (MSc) 4, R. Sotoudeh (BSc) 5 1.Young Rearchers club Astara Branch, Islamic Azad University, Astara, I.R.Iran 2.Department of Medicine, Faculty of Medicine, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, I.R.Iran 3.Department of Biotechnology, Faculty of Science, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R.Iran 4.Department of biology, Faculty of Science, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, I.R.Iran 5.Department of Chemistry Faculty of Science, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, I.R.Iran J Babol Univ Med Sci; 19(5); May 2017; PP: Received: Feb 7 th 2017, Revised: Feb 22 th 2017, Accepted: Apr 9 th ABSTRACT BACKGROUND AND OBJECTIVE: Plants of mint family with their antimicrobial properties are used to treat infectious diseases. This study aims to analyze the inhibitory effects as well as synergistic and antagonistic effects of alcoholic extract of Stachys byzantina on five standard strains under in vitro conditions. METHODS: In this experimental study, after gathering, Stachys byzantina was dried in the shade far from direct light. The maceration technique was used to prepare alcoholic extract. The effect of extract was analyzed based on disk diffusion technique using concentrations of 62.5, 125, 250 and 500 mg/ml and about 20 μl of the extract was tested. The microbial strains were purchased in the form of lyophilized strains. In order to determine MIC and MBC, microdilution method was used. Moreover, the synergistic effect of the extract was analyzed with antibiotic. FINDINGS: In this study, the greatest effect of the extract was observed to be on Staphylococcus epidermidis at concentration of 500 mg/ml (23±1.7 mm). However, this effect on Staphylococcus aureus, Streptococcus Group A and Pseudomonas aeruginosa was found to be 18.4±1.8 mm, 14.4±2.4 mm and 11.7±2.4 mm, respectively. In addition, as the concentration of the extract increased, the inhibition zone diameter increased significantly (p 0.05). Synergistic activity of the extract was shown with gentamicin, erythromycin and penicillin with Pseudomonas aeruginosa. The phytochemical results indicated the presence of alkaloid, carbohydrate, tannin, terpenoid, steroid, saponin and flavonoid. CONCLUSION: It seems that the extract of Stachys byzantina has inhibitory effect, either alone or in combination with other antimicrobial agents and improves the performance of some of the antibiotics. KEY WORDS: Alcoholic extract, Stachys byzantina, Phytochemical compound, Antimicrobial activity, Synergistic effect. Please cite this article as follows: Safarkar R, Bonabi R, Massiha A, Rezaei Nazifi M, Sotoudeh R. An Evaluation of the Inhibitory and Synergistic Effects of Alcoholic Extract of Stachys Byzantina on Standard Strains under in vitro Conditions. J Babol Univ Med Sci. 2017;19(5): Corresponding author: A. Massiha (PhD) Address: Department of Biotechnology, Faculty of Science, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, I.R.Iran Tel: amirmassiha@yahoo.com

7 65 J Babol Univ Med Sci; 19(5); May 2017 An Evaluation of the Inhibitory and Synergistic Effects ; R. Safarkar, et al References 1.Tenover FC. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 2006;119(6): Kennedy DA, Seely D. Clinically based evidence of drug herb interactions: a systematic review. Expert Opin Drug Saf. 2010;9(1): Sharafzadeh S, Alizadeh O. Some medicinal plants cultivated in Iran. 2012;2(1): Mazandarani M, and Khormali, A. Autecology, ethnopharmacology, total phenol and flavonoids and antioxidant activity of Ditrichia graveolens (L) Greuter. In different extraction from Bandargaz region. Eco phytochemical J. 2015;6(2):69-78.[In Persian]. 5.van der Kooy F, Sullivan SE. The complexity of medicinal plants: The traditional Artemisia annua formulation, current status and future perspectives. J Ethnopharmacol. 2013;150(1): Mazandarani M, Majidi Z, Zarghami-Moghaddam P, Abrodi M, Hemati H, Fathiazad F. Essential Oil composition, total phenol, flavonoid, anthocyanin and antioxidant activities in different parts of artemisia annua L. J Med Plant Bypro. 2012;1(1): Sharifzadeh M, Sharifzadeh, K., Khanavi, M., Hadjiakhoond, A., and Shafiee, A. Anti-inflammatory activity of aerial parts of Stachys setifera and Stachys persica. Int J Pharmacol. 2005;1(2):132-7.[In Persion]. 8.Maleki N, Garjani A, Nazemiyeh H, Nilfouroushan N, Sadat AE, Allameh Z, et al. Potent anti-inflammatory activities of hydroalcoholic extract from aerial parts of Stachys inflata on rats. J Ethnopharmacol. 2001;75(2): Kartsev V, Stepanichenko N, Auelbekov S. Chemical composition and pharmacological properties of plants of the genus Stachys. Chem Natural Compound. 1994;30(6): Norouzi Arasi H, Yavari I, Kia Rostami V, Jabbari R, Ghasvari Jahromi M. Volatile constituents of Stachys inflata Benth. from Iran. Flavour Fragr. J ;21(2): Santos CCdMP, Salvadori MS, Mota VG, Costa LM, de Almeida AAC, de Oliveira GAL, et al. Antinociceptive and antioxidant activities of phytol in vivo and in vitro models. Neurosci J. 2013;2013: Sonboli A, Salehi P, Ebrahimi SN. Essential oil composition and antibacterial activity of the leaves of Stachys schtschegleevii from Iran. Chem Natural compound. 2005;41(2): Skaltsa HD, Lazari DM, Chinou IB, Loukis AE. Composition and antibacterial activity of the essential oils of Stachys candida and S. chrysantha from southern Greece. Planta Medica. 1999;65(03): [In Persian]. 14.Sindambiwe J, Calomme M, Cos P, Totte J, Pieters L, Vlietinck A, et al. Screening of seven selected rwandan medicinal plants for antimicrobial and antiviral activities. J Ethnopharmacol. 1999;65(1):71-7. [In Persian]. 15.Yuan R, Lin Y. Traditional Chinese medicine: an approach to scientific proof and clinical validation. Pharmacol Therapeutics. 2000;86(2): Bodeker G. Traditional health system: valuing biodiversity for human health and wellbeing. cultural and spiritual values in biodiversity, ed DA Posey. 2000: Rechinger K. Nepeta. Flora Iran. 1982;150: Abad MJ, Bedoya LM, Apaza L, Bermejo P. The Artemisia L. genus: a review of bioactive essential oils. Molecules. 2012;17(3): Naghsh A MSM, Amjad L. Antibacterial activity of the essential oil of artemisiadeserti flowers against some pathogenic bacteria. Qom Univ Med Sci J. 2014;8(5): [In Persian]. 20.Bajpai VK, Baek K-H, Kang SC. Control of Salmonella in foods by using essential oils: A review. Food Res Inter. 2012;45(2): Guinoiseau E, Luciani A, Rossi P, Quilichini Y, Ternengo S, Bradesi P, et al. Cellular effects induced by Inula graveolens and Santolina corsica essential oils on Staphylococcus aureus. Eur J Clin Microbiol Infec Dis. 2010;29(7):873-9.

8 مجله دانشگاه علوم پزشكی بابل دوره نوزدهم/ شماره 5/ اردیبهشت 6931 ارزیابی اثرات مهاری و همافزایی عصاره الكلی گیاه سنبله رویا سفرکار و همكاران Jayasena DD, Jo C. Essential oils as potential antimicrobial agents in meat and meat products: A review. Trend Food Sci Technol. 2013;34(2): Das K, Tiwari R, Shrivastava D. Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agents: current methods and future trends. J Med Plant Res. 2010;4(2): Sattari M, Shahbazi, A, Najarpyrayh, SH. Antibacterial effect of aqueous and alcoholic extracts of eucalyptus on Pseudomonas aeruginosa. Modares J Med Sci. 2005;8(1): [In Persian]. 25.Babayi H, Kolo I, Okogun J, Ijah U. The antimicrobial activities of methanolic extracts of Eucalyptus camaldulensis and Terminalia catappa against some pathogenic microorganisms. Biokemistri. 2004;16(2): Bauer A. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 1966;45(4): Zareii B, Seyfi T, Movahedi R, Cheraghi J, Ebrahimi S. Antibacterial effects of plant extracts of Alcea digitata L, Satureja bachtiarica L and ferulago angulata L. J Babol Univ Med Sci. 2014;16(1):31-7.[In Persian]. 28.Baron E, Finegold S. Methods for testing antimicrobial effectiveness, Baily & Scotts diagnostic microbiology. NewYork: Mosby (NCCLS) NCfCLS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically 3rd ed. Approved Standard M7- A6 NCCLS, Villanova, PA, USA Madhumathi V, Deepa P, Jeyachandran S, Manoharan C, Vijayakumar S. Antimicrobial activity of cyanobacteria isolated from freshwater lake. Int J Microbiol Res. 2011;2(3): Tiwari P, Kumar B, Kaur M, Kaur G, Kaur H. Phytochemical screening and extraction: a review. Inter Pharma Sci. 2011;1(1): Krishnaiah D, Sarbatly R, Bono A. Phytochemical antioxidants for health and medicine a move towards nature. Biotechnol Mol Biol Rev. 2007;2(4): Nurdiani R, Firdaus M, Prihanto AA. Phytochemical screening and antibacterial activity of methanol extract of mangrove plant (Rhizophora mucronata) from Porong River Estuary. J Basic Sci Technol. 2012;1(2): Ghoran SH, Mighani H, Ebrahimi P. In-Vitro anti-bacterial activity of chloroform, ethyl acetate and hydroalcoholic extracts of Scilla persica Hausskn. J Gorgan Univ Med Sci. 2014;16(1): [In Persian]. 35.Norajit K, Laohakunjit N, Kerdchoechuen O. Antibacterial effect of five Zingiberaceae essential oils. Molecul. 2007;12(8): McDonnell G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance. Clin Microbiol Rev. 1999;12(1): Schlievert P, Deringer JR, Kim MH, Projan SJ, Novick R. Effect of glycerol monolaurate on bacterial growth and toxin production. Antimicrob Agent chemother. 1992;36(3): Dulger B, Ugurlu E, Aki C, Suerdem TB, Camdeviren A, Tazeler G. Evaluation of antimicrobial activity of some endemic Verbascum., Sideritis., and Stachys. species from Turkey. Pharma Biolog. 2005;43(3): Khafagi IK, Dewedar A. The efficiency of random versus ethno-directed research in the evaluation of Sinai medicinal plants for bioactive compounds. J Ethnopharmacol. 2000;71(3): Spratt BG. Resistance to antibiotics mediated by target alterations. Sci. 1994;264(5157): Tsuchiya H, Sato M, Miyazaki T, Fujiwara S, Tanigaki S, Ohyama M, et al. Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol. 1996;50(1):27-34.